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CART细胞治疗淋巴瘤中的免疫抑制和物

  • 来源:本站原创
  • 时间:2021/4/2 10:01:58

摘要

嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞在带有B细胞白血病和淋巴癌的患者中已经取得了惊人的治疗成果。尽管CART细胞在大多数的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中表现出完全缓解,但淋巴瘤治愈之路还是任重道远。不同的CAR设计和处理方案可能会影响患者反应的持续时间。然而,决定接受相同CARs治疗的患者是会起应答反应或是无效能的因素仍不可知。利用三代的CART细胞实施的临床I/IIa期试验目前正在瑞典进行,以期通过比较患者的肿瘤生物学和免疫学上来判定其治疗应答效果。对这类患者来说,CART细胞治疗是一个很好的治疗方案,但是我们仍很有必要对多因子的作用机制进行基础研究,从而给患者提供最佳的生存选择。该研究对CART细胞实现成功扩增,而不仅限于CD19+B细胞恶性肿瘤,也至关重要。这篇综述集中阐述了淋巴瘤治疗中导致可能的障碍的因素,从而发展下一代的CART细胞治疗。

引言

嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞是基因工程改造的表达肿瘤靶向受体的T细胞。该受体包含T细胞受体复合物(TCR)的信号域和抗原识别结构域,如某个抗体的单链片段(scFv)。因此,独立于天然TCR的CART细胞,能通过CAR受体识别肿瘤细胞。不同于TCR介导的通过主要组织相容性复合物(MHC)分子上的蛋白多肽来识别靶细胞,CART细胞是非MHC依赖的。CART细胞能识别肿瘤细胞表面的任意靶点,而且由于抗体可以结合糖类和脂类,它也不仅仅局限于结合蛋白质。在所有的肿瘤靶向治疗中,为了避免损坏健康组织,靶点需要特异性在肿瘤细胞表面表达。从很多方面来看,B细胞恶性肿瘤是靶向治疗如CART细胞治疗的理想对象。B细胞很容易被特异性的、具有选择性的标记如CD19、CD20分子和Igkappa或是轻链进行靶向标记。考虑到由于B细胞缺陷导致的感染疾病的持续问题可以通过免疫球蛋白替换治疗方案来解决,可以将正常B细胞亚群连带恶性B细胞一起清除。而且造血干细胞会分泌新的B细胞,这些B细胞缺乏前述的B细胞标志,这样就不会被CAR-T细胞杀伤。

B细胞恶性肿瘤是一个多项指标,涉及到实体损伤,以及血液和骨髓中的循环细胞。使用CART细胞治疗B细胞恶性肿瘤给我们提供了一个学习不同CAR作用机制的机会,了解靶向毒性和脱靶毒性,同时也可以让我们了解CART细胞在免疫逃逸机制敏感性方面和实体肿瘤的物理障碍方面的局限性。

B细胞恶性肿瘤

B细胞恶性肿瘤包括来自不同分化阶段的B细胞肿瘤。例如,前B急性淋巴细胞白血病(前B-ALL)来源于骨髓中前B细胞发育阶段的祖细胞,而弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)源自淋巴组织生发中心的B细胞。另外,慢性淋巴细胞白血病(CLL)的血液、骨髓、淋巴组织中具有成熟的B细胞表型,血液中也出现有肿瘤细胞。然而,它们都有一定的共同点,就是它们都来源于B细胞而且都有一些共同的可用于靶向治疗的B细胞系标记分子。例如,CD20在成熟的B细胞中表达,目前靶向CD20的抗体利妥昔单抗在化疗中用来治疗CD20+恶性肿瘤。另一个B细胞标记是CD19,CD19在健康的祖B细胞和成熟B细胞中表达,而不在恶性的浆细胞中表达。临床上运用靶向CD19分子的CAR-T细胞进行免疫治疗已经取得了惊人的成果,主要对象是急性淋巴细胞白血病以及淋巴瘤患者。另一个B细胞靶标是膜结合抗体,设计的CAR-T细胞主要是靶向IgKappa或是lambda链。

B细胞白血病和淋巴瘤对治疗的反应不同。ALL能通过化疗治愈,但是复发或难治的患者预后较差。对于难治的ALL患者,异体造血干细胞移植(HSCT)是唯一的治疗方案,但是HSCT术后复发目前还是不可治愈的。CLL是一种慢性疾病,这种疾病有不同的临床过程,对化疗有不同的反应。对于难治的CLL患者,现在有一套新的信号抑制剂,这种信号抑制剂通过靶向PI3Kδ和Bruton’s酪氨酸激酶(BTK)来抑制CLL中B细胞受体驱动的细胞增殖。DLBCL是一种侵袭性淋巴瘤,最初是用利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(R-CHOP)治疗的。DLBCL通常治疗效果良好,大约60%的患者可以用强的松治愈。复发患者会表现出强的耐药性,但是使用大剂量化疗和自体HSCT可能仍然会有应答。

免疫疗法对癌症患者和B细胞恶性肿瘤有很大的影响,表达靶向CD19的CART细胞在过去几年中取得了惊人的疗效。T细胞是优秀的持续杀伤型细胞,它在适宜条件下可以扩增、生存和杀死肿瘤细胞。在体内,它们可以作为效应记忆细胞持续应答,而诸如利妥昔单抗这样的单抗药物不能诱导产生肿瘤免疫原性。进一步来说,单抗具有肿瘤细胞结合能力,可以诱导抗体介导细胞毒性杀死肿瘤细胞,而CART细胞会在体内增殖而且会产生持续细胞毒性活性。不过,在一些实验中患者已经表现出完全缓解,其他的会出现短暂的局部应答。我们很难直接比较一些已经公布的利用CAR-T细胞进行治疗的试验结果,因为CART细胞使用过程中会有不同的设计、不同的预处理方案,选择的患者也会有所不同(如白血病患者和淋巴瘤患者)。

CAR-T细胞设计

CAR分子包含抗原识别的胞外域和胞内域。胞外域是典型的针对细胞表面抗原的单链抗体片段(scFv),而胞内域包含源于TCR和共刺激信号域(图1)。抗原提呈细胞诱导的多信号级联可以控制T细胞激活。T细胞激活需要抗原递呈细胞的多信号级联反应诱导。实现T细胞激活需要通过TCR刺激的抗原识别联合一系列蛋白CD28、CD27和4-1BB共同刺激的信号作用。第一代的CAR-T细胞通过连接靶向肿瘤的scFv和TCRCD3复合物的ζ链就可以模仿TCR的刺激,它可以进行T细胞识别从而在体外杀死肿瘤细胞,但缺乏体内的持续性。第二代CAR细胞包含源自共刺激分子的信号域。共刺激信号可以使T细胞更好的增殖,而且共刺激通过融合到CAR细胞可以生产更多的细胞因子。第二代CAR-T细胞含CD28共刺激因子对Tregs及其抑制分子IL10和TGFβ敏感度较低。第二代CAR细胞用于治疗ALL是有效的,但在淋巴瘤患者体内的持续时间有待提高。宾夕法尼亚大学设计的CART细胞是用4-1BB分子代替CD28作为共刺激因子。这给CART细胞提供了一个重要的生存和扩增信号,可能也解释了患者对它的持久应答。后来的实验中,在大约90%的ALL患者中最初可以观测到完全缓解,多数患者会有持久应答。如果在注射前只对患者实施大剂量的化疗来降低Tregs和髓源性抑制细胞(MDSCs),CART细胞对各种淋巴瘤依然是有效的。另外,抑制免疫细胞会阻碍CART细胞的作用。最近,NIH用包含CD28的第二代CAR–T细胞进行的研究表明:完全缓解需要的高剂量会导致淋巴瘤患者产生严重的毒副作用。但是为什么ALL患者的治疗效果比淋巴瘤患者好,是否其他类型的CART细胞设计对淋巴瘤更适用目前还不清楚。

实验表明,CD28和4-1BB共同刺激的T细胞抗癌活性会更好,而且在体内的生存时间比二者任一刺激的都长,这也就说明了这两种分子是起协同作用的。在瑞典的乌普萨拉大学,我们最近研究了第三代CART细胞的临床表现。在ALL和淋巴瘤患者中已经都可以观测到缓解,但是淋巴瘤患者对治疗表现出更强的耐药性。最近我们通过研究淋巴瘤患者损伤的切片说明这种耐药机理,该机理有助于未来进行CAR设计和定义必需的联合治疗药物。关于为何CART细胞对淋巴瘤不像对白血病那么有效有三种合理的解释。首先,淋巴瘤是实体肿瘤,它给CART细胞近距离接触肿瘤细胞带来了物理障碍。其次,调节性免疫细胞和抑制蛋白集中在肿瘤附近。因此,实体肿瘤的肿瘤位点的免疫抑制性更强,从而保护肿瘤细胞远离CAR-T细胞。第三,CART细胞可能缺少进入实体肿瘤的归巢受体。被激活的T细胞倾向于迁移循环而不是回到淋巴组织,这可能使清除淋巴节点的肿瘤细胞更加复杂。

CART细胞浸润的物理障碍

众所周知,大多数的肿瘤中都存在T细胞,而且肿瘤浸润T细胞的数量与其总生存期有关。然而,有实验结果表明大多数的T细胞存在肿瘤基质中,很少或者几乎没有T细胞浸润进入软细胞组织。有几个因素可能会抑制其浸润进入软组织细胞。例如,肿瘤病灶中的血管功能失常,不表达必要的受体如:ICAM-1、VCAM-1和P/E选择蛋白使T细胞不能粘附、滚动以及血球渗出。T细胞可能不仅缺失它对应的受体例如整联蛋白α4β1(VLA-4)和LFA-1,也缺失移动到软组织细胞的PSGL-1和CD43。为了便于T细胞移行,内皮细胞能通过CD40激活上调粘附受体。因此,CART细胞免疫疗法结合靶向CD40疗法可能对治疗淋巴瘤有好处。此外,树突细胞(DCs)上的CD40刺激具有Th1介导免疫,这进一步完善了CART细胞治疗。实际上,Curran等人最近发布了可以表达重组CD40配体(CD40L)的CART细胞,CD40配体可以使T细胞在肿瘤局部位置存活。

如果CD40L活化内皮细胞,它可能也会促进T细胞浸润进入肿瘤细胞中。然而,在小鼠实验中,淋巴细胞中组成型的CD40L表达会导致淋巴组织增生混乱,在体内使用表达CD40L的CART细胞还需要谨慎进行。我们可能也需要设计CART细胞去表达趋化因子受体使其回归到肿瘤细胞。例如,肿瘤细胞经常释放CCL2和CXCL5,用来募集巨噬细胞,髓源性抑制细胞以及中性粒细胞到肿瘤细胞。通过表达CAR细胞中的CCR2或者CCR4,能让CART细胞更好的归巢到肿瘤组织。但是,位于肿瘤节点的淋巴瘤可能会通过其他方式被标记。血液内的Na?veT细胞能通过专门的高内皮静脉(HEVs)进入淋巴节点,但是这个过程对于效应细胞来说作用不大。相反,效应和记忆细胞是通过淋巴管进入淋巴结点。T细胞能通过HEVs连接选择蛋白从而进入淋巴管。趋化因子CCR7对T细胞回到淋巴结非常重要,CCR7可以在Na?ve和记忆细胞群中表达,而效应细胞通常缺失CCR7。因此,通过CCR7表达的效应/记忆表型对CART细胞进行扩增的方案能让它们迁移进淋巴结。不过,在体内T细胞会丢失CCR7表达,为了维持其进入淋巴节点可能需要CCR7在CAR细胞进行反式表达。

肿瘤细胞和肿瘤基质,如M2巨噬细胞,经常表达VEGF刺激血管生成,淋巴瘤上也是如此。已有数据表明VEGF能够阻止T细胞浸润进入肿瘤细胞,通过酪氨酸激酶抑制剂(TKI)舒尼替尼上调趋化因子,阻断VEGF信号通路,然后增强T细胞浸润能力。众所周知,舒尼替尼可以抑制肾癌中的髓源性抑制细胞,如果将其与CAR-T细胞进行联合治疗,将会增强CAR-T细胞的治疗。不过,由于TcR复合体和共激分子下游的许多信号路径可能需要酪氨酸激酶,所以需要进一步研究舒尼替尼在T细胞中的影响。

实体肿瘤中物理障碍也会阻止T细胞侵入细胞外基质尤其在肿瘤密度比较大的位点,可能是因为胶原生成纤维母细胞。有趣的是,与细胞外基质的重塑和炎症反应有关的基因表达水平在DLBCL患者中表达要更高。这些患者后通过化疗获得了治愈。巨噬细胞产生的基质金属蛋白酶12在被治愈的患者体内是增加的,这些患者体内也有大量的浸润性T细胞。在Caruana等人的研究中,结构性表达类肝素酶的CART细胞浸润肿瘤的能力更强,而且会增加其在小鼠体内的总生存率存。实验数据还表明设计合适的CART细胞可能会解决这些物理障碍。

充满敌意的肿瘤微环境

对免疫疗法来说,免疫抑制作为一种可以避开抗肿瘤反应的方法目前是最大的困难。肿瘤能释放像TGFβ和IL10这样能直接阻碍T细胞扩散和细胞毒性作用的抑制物。这些物质也能阻碍抗原提呈细胞,从而阻止T细胞被激活。而且,TGFβ在使T细胞变异为Tregs的过程中起到了重要作用,IL10促进了M2巨噬细胞的变异。Tregs又会进一步加强TGFβ、IL10和其他像IL35和腺苷这样的抑制剂的作用。M2巨噬细胞有抗炎症、促进血管生成及致癌的作用。

M2巨噬细胞不仅会产生IL10和TGFβ,还会产生CCL22去吸引CCR4+Tregs。而且,它们能表达PDL1并且抑制激活PD1+T细胞。肿瘤细胞会产生前列腺素E2,它能促进髓源性抑制细胞的增长。MDSCs是在不同的变异阶段未成熟的骨髓细胞,这些细胞也具有抑制力。它们有许多抑制机制,例如,它们能释放精氨酸酶-1和上调的NO合成酶2,这些酶都与L-精氨酸的新陈代谢有关。缺少L-精氨酸的T细胞中的CD3ζ会减少,也会失去增殖能力。Tregs、MDSCs和M2巨噬细胞会创造一个和T细胞非常敌对的环境,这个环境集中在肿瘤病灶,但是对患者整体都会造成影响。在CLL患者中,免疫抑制过早出现会导致T细胞、NK细胞和单核细胞紊乱。CD+M2巨噬细胞会浸润淋巴瘤细胞,这与预后效果差有关。MDSCs与低的总存活率有关。但是,Tregs在B细胞恶性肿瘤中的作用是相对矛盾的,它与较好的预后有关。

源于免疫细胞的Tregs在肿瘤中起双重作用,这是由于它们的主要功能是抑制这类细胞。因此,当发生抑制抗肿瘤免疫作用时,Tregs可能会抑制肿瘤细胞。在以前实验中,我们发现患有B细胞白血病患者或者淋巴瘤患者的体内有更高级别的Tregs,而且他们的Tregs表现出细胞溶解性。这些Tregs在体外可以杀死B细胞肿瘤。但是,所有抑制细胞和B细胞淋巴瘤中的细胞因子就是一个抑制免疫环境,会阻碍T细胞作用。我们做的一个试点实验表明在CLL和DLBCL患者中Tregs会升高,但是ALL患儿和同龄的健康人Tregs级别相似。但是,通常TGFβ级别较高的也就是ALL高风险患者。这些数据可以解释为什么患者对CAR-T细胞治疗有更好的缓解。

患者接受CAR-T细胞治疗的条件

如果患者没有接受预处理治疗,那么CART细胞治疗就会受到限制。对于接受免疫治疗的患者一般会实施预处理治疗来降低Tregs和MDSCs,否则可能会妨碍计划免疫激活。化疗诱导的淋巴细胞或者骨髓细胞损耗可能会诱导骨髓细胞因子产生,从而恢复免疫细胞数量并且有助于抗肿瘤反应激活。最常用的是NIH的治疗方案:在注射之前使用氟达拉滨和环磷酰胺扩增抗黑素瘤特异性的T细胞。这个方法通常在注入CART细胞之前使用,但是由于毒性问题,这个方法要按说明实施。为了控制抑制型免疫细胞,需要有规律的给接受免疫治疗的患者注入一段时间的环磷酰胺。如果不妨碍理想的抗肿瘤作用的话,这个化疗方案是很有价值的。这个化疗方案的其中一个


本文编辑:佚名
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